Ponadto, wszyscy pacjenci biorący udział w badaniu byli testowani na obecność przeciwciał przeciwko Helicobacter pylori. Wykrywanie IgG4 i anty-H. Przeciwciała pylori
Poziomy IgG4 w surowicy określano za pomocą dostępnego w handlu zestawu immunonefelometrycznego (Nefelometr BNII, Dade Behring). Górną granicę normalnego zakresu poziomów IgG4 w surowicy uznawano za 135 mg na decylitr, jak donosi Hamano i wsp. 11. Przeciwciała IgG przeciwko H. pylori wykrywano przy użyciu dostępnego na rynku zestawu (Enzygnost, Siemens).
Biblioteka peptydów
Losową bibliotekę peptydów dodekameru, która pokazuje peptydy na powierzchni Escherichia coli, zakupiono od Invitrogen i przeszukiwano pulowanymi immunoglobulinami oczyszczonymi z próbek surowicy od 20 pacjentów z autoimmunologicznym zapaleniem trzustki, zgodnie z instrukcjami producenta (FliTrx Panning Kit, Invitrogen). Po pięciu rundach eksperymentów z użyciem biopanningu, wzbogacono bibliotekę i pojedyncze kolonie indukowano tryptofanem w celu ekspresji peptydów fuzyjnych. Bakterie poddano lizie w buforze do próbek i badano za pomocą metody Western blot z frakcją immunoglobulinową u pacjentów z autoimmunologicznym zapaleniem trzustki, w celu sprawdzenia klonów pozytywnych. DNA ekstrahowano z pozytywnych klonów i sekwencjonowano. Zestaw 15 z 30 peptydów uzyskanych z ostatniej rundy biopanningu został zsyntetyzowany i użyty w teście immunoleptycznym z fluorescencją wzmocnionym dysocjacją (DELFIA) do testowania próbek surowicy od poszczególnych pacjentów.
Synteza peptydów
Wszystkie syntetyczne peptydy, w tym peptyd autoimmunologiczny (AIP) (SKDERRFEQPRV), peptyd AIP1-7 (SKDERRF), peptyd AIP6-12 (RFEQPRV), peptyd wiążący plazminogen (PBP) (AKEERRY), ubikwityna -przeciwciało dla białka E3 ligazy E3, peptyd n-rozpoznny 2 (UBR2) (AKEQRRQ) i nieistotny peptyd kontrolny (VTLPKDSDVELP), zostały ręcznie zsyntetyzowane za pomocą standardowej metody syntezy peptydów w fazie stałej; ta metoda wykorzystuje strategię 9-fluorenylometoksykarbonylową z niewielkimi modyfikacjami.18
Ocena wiązania przeciwciał
DELFIA jest metodą fluorescencji czasowo-rozdzielczej, którą można wykorzystać do badania wiązania przeciwciała z białkami lub peptydami w fazie stałej. Peptydy stosowano w stężeniu 20 .g na mililitr w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem do powlekania płytek DELFIA (PerkinElmer). Płytki następnie blokowano przez godzinę odczynnikiem blokującym (PerkinElmer). Próbki surowicy rozcieńczono w roztworze 1:50 w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem i 1% albuminie surowicy bydlęcej (Sigma) i inkubowano na płytkach przez noc w 4 do 8 ° C. Płytki następnie przemyto 10 razy buforem do przemywania (PerkinElmer). Związane przeciwciała wykrywano przeciwciałem anty-ludzkim IgG wyznakowanym europem (1: 500 w buforze do rozcieńczeń, PerkinElmer). Płytki odczytywano na przyrządzie Victor3 (PerkinElmer), a dane analizowano za pomocą oprogramowania dostarczonego z przyrządem DELFIA. Wartości absorbancji wyższe od średniej (+3 SD) dla każdego rozcieńczenia surowicy w grupie kontrolnej uznano za pozytywne.
Produkcja antyserumów króliczych
Przeciwciała poliklonalne przeciwko peptydowi odpowiadającemu PBP H. pylori, reszty aminokwasowe 298 do 309 (AKEERRYLRDER) wytworzono w białych królikach nowozelandzkich za pomocą standardowych technik.
Western Blotting
H
[więcej w: omułek zielonowargowy kapsułki, anestezjologia larsen, rurka tracheostomijna metalowa ]
Powiązane tematy z artykułem: anestezjologia larsen omułek zielonowargowy kapsułki rurka tracheostomijna metalowa