Ekstrakt wzbogacono w PBP za pomocą chromatografii powinowactwa z użyciem kolumny Sepharose sprzężonej z króliczym przeciwciałem anty-PBP królika (patrz powyżej). Bloty sondowano pierwszorzędowymi przeciwciałami, a następnie przeciwciałami przeciwko ludzkiej immunoglobulinie połączonymi peroksydazą lub przeciwciałami anty-iglicowymi IgG (Sigma). Lizaty komórek HeLa przygotowano przy użyciu dostępnego w handlu zestawu (Nuclear Extract Kit, Active Motif). Lizaty komórkowe poddano immunoprecypitacji za pomocą mysich przeciwciał poliklonalnych przeciwludzkich rekombinowanych UBR2 (aminokwasy do 439) (Abnova) usieciowanych do Sepharose. Wyeluowane białka rozdzielono za pomocą elektroforezy w żelu sodowym z dodecylosiarczanem-poliakrylamidem i przeniesiono na membranę nitrocelulozową (Amersham Biosciences). Bloty inkubowano z mysimi przeciwciałami anty-UBR2, oczyszczonymi ludzkimi przeciwciałami (10 .g na mililitr) lub próbkami surowicy (przy rozcieńczeniu 1:50 w buforze). Do wykrywania wykorzystano renesansowy zestaw chemiluminescencyjny (NEN Life Science Products). Analiza statystyczna
Oceniliśmy czułość i swoistość testu za pomocą analizy krzywej charakterystyki odbiornika (ROC), szacując obszar pod krzywą (AUC) z 95% przedziałami ufności. Analizę statystyczną przeprowadzono za pomocą oprogramowania SPSS, wersja 13 (SPSS).
Wyniki
Biblioteka peptydów
Tabela 2. Tabela 2. Peptydy stosowane w homologii badań i sekwencji. Przebadaliśmy bibliotekę peptydów połączonymi immunoglobulinami pochodzącymi z panelu 20 pacjentów z autoimmunologicznym zapaleniem trzustki w celu zidentyfikowania tylko tych peptydów, które mogły mieć znaczenie dla patogenezy choroby. Za pomocą DELFIA zidentyfikowaliśmy peptyd (peptyd AIP SKDERRFEQPRV), który został rozpoznany przez IgG w próbkach surowicy od 17 z 20 pacjentów z autoimmunologicznym zapaleniem trzustki (85%), ale nie przez surowicze IgG ze zdrowych kontroli. Jednak z tymi peptydami reagowały próbki surowicy pobrane od 22 z 40 pacjentów z rakiem trzustki (55%) i 10 z 21 pacjentów z przewlekłym zapaleniem trzustki wywołanym alkoholem (50%). Aby lepiej odwzorować reaktywność immunoglobulin w kierunku tego epitopu i lepiej odróżnić autoimmunologiczne zapalenie trzustki od raka trzustki, postanowiliśmy zsyntetyzować dwa peptydy – peptyd AIP1-7 (SKDERRF) i peptyd AIP6-12 (RFEQPRV) (tabela 2).
Peptyd AIP6-12 został rozpoznany przez próbki surowicy od 4 z 20 pacjentów z autoimmunologicznym zapaleniem trzustki (20%) i od 20 z 40 pacjentów z rakiem trzustki (50%). Peptyd AIP1-7 został rozpoznany przez próbki surowicy od 18 z 20 pacjentów z autoimmunologicznym zapaleniem trzustki (90%) i od 4 z 40 pacjentów z rakiem trzustki (10%). Dane te pokazują, że sekwencja peptydowa AIP1-7 zawiera epitop rozpoznawany przez prawie wszystkie próbki surowicy od pacjentów z autoimmunologicznym zapaleniem trzustki.
H. pylori i autoimmunologiczne zapalenie trzustki
Ponieważ zakażenie H. pylori powiązano z patogenezą autoimmunologicznego zapalenia trzustki, 19-21 postanowiliśmy porównać sekwencję peptydową AIP1-7 ze znanymi białkowymi sekwencjami bakteryjnymi w banku danych białek (baza danych Swiss-Prot), stosując oprogramowanie BLASTP z Podstawowe usługi sieci wyszukiwania lokalnego (BLAST) National Center for Biotechnology Information (NCBI)
[hasła pokrewne: mydlo marsylskie, bronchografia, omułek zielonowargowy kapsułki ]
Powiązane tematy z artykułem: bronchografia mydlo marsylskie omułek zielonowargowy kapsułki